Imagerie cellulaire à l’aide de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale

Abstract

Source : Daniele, F., et. al Sondes TIRFM et GFP sensibles au pH pour évaluer la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome SH-SY5Y : imagerie cellulaire et analyse des données. J. vis. exp. (2015).

Cette vidéo montre l’imagerie de cellules de neuroblastome humain à l’aide d’un microscope à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser les vésicules synaptiques marquées au fluorophore. Les cellules sont d’abord focalisées en mode épifluorescence. Des ajustements sont ensuite effectués pour obtenir une réflexion interne totale, générant des ondes évanescentes qui excitent sélectivement les fluorophores près de la membrane. Avant l’imagerie TIRF, les paramètres d’acquisition sont configurés et la fréquence d’échantillonnage est définie.

Protocol

1. Culture cellulaire et transfection

1. SH-SY5Y culture cellulaire
   REMARQUE : Les expériences ont été réalisées à l’aide du neuroblastome humain SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). Les cellules SH-SY5Y se développent sous la forme d’un mélange d’amas flottants et de cellules adhérentes. Suivez les instructions rapportées dans le protocole (densité cellulaire, rapport de division, etc.) pour que les cellules qui se développent soient fermement attachées au couvercle en verre, ce qui est crucial pour la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM).
   1. Avant de commencer, sous l’enceinte de biosécuri....

Results

Graphique 1. Installation du microscope TIRF. Vue schématique et image (en médaillon) du système de microscope TIRF. L’installation comprend le microscope inversé motorisé Axio Observer Z1 (A), un laser Argon-ion multiligne de 100 mW (B) et.......

Materials